C
شکل ۴-۴: ریشهزایی و سازگاری: -A گیاهچههای ریشهدار شده در محیط ریشهزایی. B- گیاهچه قرار گرفته در گلدان برای سازگاری. C- گلدان های قرار گرفته در جعبههای پلاستیکی شفاف برای حفظ رطوبت نسبی. D- گیاهچه انتقال داده شده به گلخانه.
فصل پنجم
بحث
جوانهزنی
اثر روش های مختلف ضدعفونی بذر، بر جوانهزنی از لحاظ آماری معنیدار بود. نتایج استریلکردن بذور با هیپوکلریتسدیم ۱ درصد در زمان های مختلف، نشان داد که با افزایش زمان استریل، درصد و سرعت جوانهزنی بذور کاهش یافت. با افزایش زمان استریل کردن، مقادیر موسیلاژ اطراف بذر افزایش یافت، بنابراین جذب اکسیژن با مشکل مواجه شد و سرعت جوانهزنی بذر کاهش یافت. Orphanos(1983) اظهار داشت که در Caper (Caparis spinosa L.)، موسیلاژ پوشش بذر، نفوذ اکسیژن به جنین را محدود می کند، بنابراین باعث ممانعت در جوانهزنی بذر می شود. به نظر میرسد که در این پژوهش با افزایش زمان ضدعفونی، هیپوکلریتسدیم به داخل بذر نفوذ کرده و باعث آسیب به جنین شد و بنابراین درصد و سرعت جوانهزنی کاهش یافت. Tomita (1998) به این نتیجه دست یافت که با افزایش زمان تیمار بذور Calypso bulbosa با هیپوکلریتسدیم، بذور آسیب دیدند و سرعت جوانهزنی کاهش یافت.
در این تحقیق در محیطهای WFP و WA، درصد و سرعت جوانهزنی در مقایسه با محیط MS کم بود. از طرف دیگر گیاهچههای بدست آمده به خاطر فقدان مواد غذایی، قدرت رشد کافی را نداشته و ضعیف بودند.
با اضافه کردن کیتوسان به محیط کشتف تفاوت معنیداری در سرعت و درصد جوانهزنی بدست آمد. همه غلظتهای کیتوسان به طور معنیداری سرعت جوانهزنی را در مقایسه با محیط شاهد (بدون کیتوسان) در بذور مریمگلیکبیر مورد آزمایش، افزایش دادند. Zhou و همکاران (۲۰۰۲) گزارش دادند که در بذور Peanut خیسانده شده در محلول کیتوسان، قدرت جوانهزنی و درصد جوانهزنی، فعالیت لیپاز و اسید جیبرلیک (GA3) و سطوح ایندول استیک اسید (IAA) افزایش یافت. کیتوسان یک ترکیب آلی نسبتاً ارزان و فراوان است. کیتوسان باعث افزایش آنزیم β-۱,۳-glucanases (β-Glu) می شود. گفته شده که β-Glu نه تنها به دفاع بذور در مقابل پاتوزنها کمک می کند، بلکه همچنین یک فاکتور کلیدی در تنظیم خواب ناشی از پوشش بذر و جوانهزنی بذر در پاسخ به عوامل هورمونی و محیطی است (Gerhard, 2003). در این تحقیق با افزایش کیتوسان به محیط جوانه زنی بذر، رنگ برگها به خاطر فتوسنتز و محتوای کلروفیل بیشتر، تیره تر از برگ گیاهان شاهد بود. در تطابق با این نتایج، Ait Barka و همکاران (۲۰۰۴) گزارش کردند که فتوسنتز و پارامترهای وابسته به آن در گیاهچه های Vitis vinifera L. تیمارشده با کیتوسان، تحریک شدند.
در این تحقیق، اثرات سطوح pH، روی جوانهزنی بذر مورد مطالعه قرار گرفت و مشاهده شد که در ۸-۷ =pH جوانهزنی بذر بهتر صورت گرفت. نتایج این مطالعه در تطابق با نتایج مطالعات در Begonia (Begonia sp.)، Impatiens (Impatiens wallerana)، Allyssum (Lobularia moritima)، Petunia (Petunia sp.) و Salvia (Salvia splendens) بود که در ۵ = pH جوانهزنی صورت نگرفت، یا اینکه در این محدوده، جوانهزنی در گیاهان Ageratum (Ageratum houstonianum) و Marigold (Tagetes patula) خیلی کم بود. با افزایش محدوده pH از۵/۴ به ۵/۵ برای گیاه Geranium و از ۵ تا ۵/۶ برای Salvia جوانهزنی افزایش یافت (Shoemaker and Carlson, 1990).
اثرات نوع ریزنمونه بر باززایی
در تحقیق حاضر که اثر ریزنمونههای مختلف (گره، نوک شاخه، هیپوکوتیل و کوتیلدون) در محیطهای کشت دارای غلظتهای مختلف تنظیمکننده های رشد گیاهی در باززایی مستقیم مریمگلیکبیر مورد بررسی قرار گرفت، مشاهده گردید ریزنمونههای هیپوکوتیل و کوتیلدون هیچ پاسخی به باززایی ندادند و تنها در ریزنمونه های گره و نوک شاخه القای جوانه و باززایی شاخه های متعدد صورت گرفت. ریزنمونههای گره و نوک شاخه نیز پاسخهای متفاوتی در محیطهای مختلف نشان دادند. در اکثر تیمارها در ریزنمونه گره باززایی بهتر از ریزنمونه نوک شاخه صورت گرفته بود. این تفاوتها می تواند به شرایط فیزیولوژیکی ریزنمونه نسبت داده شود، که توسط فاکتورهای ژنتیکی تعیین می شود (Baroncelli et al., 1978; Nagarathna et al., 1991;). چنین پاسخ های متفاوت برای انواع ریزنمونههای مختلف و برای دیگر گونه ها گزارش شده است. عوامل متعددی مسئول اندامزایی درون شیشه ای هستند. طبیعت و وضعیت ریزنمونه، کاربرد تنظیمکننده های رشد و اثر متقابل آنها با بافتهای سالم تأثیر زیادی در باززایی دارد (Lakshmi Prabha et al., 2010). نوع ریزنمونه، محیط رشد و سطوح هورمونهای داخلی در القای شاخساره تأثیر میگذارند و این فاکتورها باعث تفاوت در مشاهدات میشوند (Kesari et al., 2012). منبع ریزنمونه مورد استفاده، برای تعیین اندام و پتانسیل تولید مهم است که به طور معنیداری تحت تأثیر شرایط فیزیولوژیکی و فتوسنتزی گیاه والد قرار میگیرد (Debergh and Maene, 1981; Read, 1988). استقرار اولیه کشت ضدعفونی شده، انتخاب دقیق، تعیین و نگهداری گیاهان پایه مورد استفاده به عنوان منبع ریزنمونه، لازم است. نگهداری گیاهان والد در شرایط محیطی کنترلشده و تمیز، ریزنمونههای استریل و سالم بدست میدهد (Sagare et al., 2001). سن فیزیولوزیکی ریزنمونهها، نوع و اندازه ریزنمونه ها از فاکتورهای دیگری است که بر تشکیل اندامها درون شیشه مؤثر هستند (Rout et al., ۲۰۰۰). موفقیت در کشت درون شیشه ای به انتخاب صحیح ریزنمونه بستگی دارد (George et al., 2008).
نوع ریزنمونه اثر زیادی روی اندامزایی و رشد شاخه های باززایی شده دارد. پاسخهای متفاوت ریزنمونه های مختلف ممکن است به تفاوت در ساختارهای داخلی آنها (Zouzou et al., 2008) دوباره فعال شدن متفاوت ریزنمونهها در ترکیبات محیط کشت (Ikram, 2005) و اثر متقابل بین نوع بافت و غلظتهای تنظیم کننده های رشد داخلی، نسبت داده شود (Kaewpoo and Te- chato, 2009).
Sharma و Nautiyal (2009) اثرات ریزنمونههای مختلف (دمبرگ، گره، نوک شاخه، میانگره و برگ) و ترکیبات تنظیمکننده های مختلف رشد (BA, IBA) را بر باززایی شاخساره در گیاه برگ بو (Laurel) (Cinnamomum tamala Nees & Ebrm) مورد بررسی قرار دادند. آنها مشاهده کردند که ریزنمونههای گره و دمبرگ بهتر از بقیه ریزنمونهها به باززایی شاخه پاسخ می دهند. Ishag و همکاران (۲۰۰۹) برای تولید شاخه از ریزنمونه نوک شاخه و کوتیلدون در گیاه گوجه فرنگی (Lycopersicon esculentum) استفاده کردند و مشاهده کردند که ریزنمونه نوک شاخه مؤثرتر از ریزنمونه کوتیلدون بود. القای مستقیم جوانههای شاخه متعدد از ریزنمونههای گره در محدوده وسیعی از گونه های گیاهی گزارش شده است (Murashige, 1974; Selvakumar et al., 2001; Das and Handique, 2002; Hassan and Roy, 2004; Sultana and Handique, 2004; Singh et al., 2011).
درآزمایش حاضر همان طور که ذکر شد در ریزنمونههای گره جانبی که در واقع جوانههای در حال خواب به دلیل غالبیت انتهایی هستند، بهتر از ریزنمونههای نوک شاخه (جوانه انتهایی)، باززایی صورت گرفت. در بسیاری از گیاهان باغی در سرتاسر زمین، جوانههای در حال خواب برای ریزازدیادی و حفاظت انجمادی استفاده شده است (Ai and Luo, 2003; Suzuki et al., 1997). جوانههای در حال خواب، اندامهای راکد با نواحی مریستمی هستند و مورفولوژی آنها قبلا مستقر شده است. بنابراین توانایی بسیاری برای باززایی و سازگاری با تغییرات شرایط کشت را دارند (Zhang et al., 2011). به علاوه این ریزنمونهها بسیار بارور هستند، از لحاظ ژنتیکی با ثباتند و میتوانند در برابر افت ناگهانی دما و همچنین یخ زدگی ناگهانی مقاومت کنند (Matsumoto et al., 2001). استفاده از جوانههای در حال خواب به عنوان ریزنمونه و باززایی گیاه از طریق ایجاد شاخه های متعدد یک راه مطلوب ازدیاد سریع درون شیشه ای گیاه Condonopsis pilosula با کمترین تفاوت در گیاهان حاصله بود (Zhang et al., 2011). در گیاه دارویی کمیاب Stemona tuberosa Lour که از ریزنمونههای مختلف گره، میانگره و برگ برای ازدیاد درون شیشه ای استفاده شد، مشاهده شد که در بین ۳ نوع ریزنمونه گره، برگ و میانگره، تنها ریزنمونههای گره پاسخ مثبت دادند. ریزنمونههای برگ و میانگره نتوانستند هیچ شاخه نابجا تولید کنند (Biswas et al., 2011). در گیاه دارویی Paederia foetida L. استفاده از ریزنمونه گره جانبی تعداد شاخه بیشتری را نسبت به ریزنمونه نوک شاخه ایجاد کرد (Amin et al., 2003). در بررسیهای Zulfiqar و همکاران (۲۰۰۹) که روی اثرات نوع ریزنمونه و غلظتهای مختلف تنظیمکننده های رشد گیاهی در پرآوری گیاه Avocado (Persea americana Mill) رقم Fuerte، با بهره گرفتن از ریزنمونههای گره جانبی و انتهایی انجام دادند، ریزنمونه گره جانبی بهترین نتیجه را داد. این محققین همچنین اذعان داشتند که پاسخهای مختلف که توسط ریزنمونههای مختلف نشان داده شده، ممکن است به خاطر فعالیت سیگنال تکثیر شاخه در محلهای مختلف باشد. حضور سطوح بالای اکسین مانع فعالیت سیگنال تکثیر شاخه می شود و به عنوان ممانعت کننده انشعاب شاخه عمل می کند (Foo et al., 2005). بنابراین امکان دارد که در جوانههای انتهایی (نوک شاخه) فعالیت سیگنال تکثیر شاخه به عنوان یک ممانعت کننده انشعاب شاخه به خاطر حضور سطوح بالای اکسین درونی باشد و پیوستن این سیگنال با غلظتهای کم اکسین در جوانههای جانبی ممکن است به عنوان یک عامل انشعاب شاخه عمل کند. از طرف دیگر به خاطر اینکه جوانههای جانبی دارای سطوح سایتوکینین درونی بیشتری هستند، باززایی حتی در غلظتهای کم سیتوکینین بهتر جواب میدهد. سیتوکینین در ریشه سنتز می شود و به طرف بالا حرکت می کند. بنابراین جوانههای جانبی به خاطر قرارگرفتن در قسمت های پایین گیاه مادری نسبت به جوانه انتهایی، از نظر سیتوکینین غنی هستند (Zulfiqar et al., 2009).
اثرات نوع و غلظت تنظیمکننده های رشد گیاهی بر باززایی
نتایج این مطالعه نشان داد که در محیط شاهد (بدون تنظیم کننده رشد) باززایی بسیار کم انجام پذیرفت و این نشان دهنده اهمیت سیتوکینینها در تحریک پرآوری و تقسیم سلولی در ریزنمونههای کشت شده و تشکیل اندام در بافتهای تیمار شده با سیتوکینین است. تعداد شاخه در ریزنمونه بستگی به غلظتهای تنظیمکننده های رشد و ژنوتیپ دارد (Faria and Iiig, 1995). نتایج این تحقیق نشان داد که با افزایش غلظت هر سه نوع سیتوکینین، اکثراً تعداد شاخه در هر دو نوع ریزنمونه افزایش یافت و این ارتباط مثبت بین غلظت سیتوکینین و تعداد شاخه باززایی شده را نشان میدهد. این حقیقت را میتوان این گونه بیان کرد که سیتوکینینها مخصوصاً در غلظتهای بالا بر غالبیت انتهایی چیره شده و تشکیل شاخه را پیش میبرند (Echererrigary and Fracaro, 2001). وجود سیتوکینین برای القای شاخه های متعدد لازم است (Abdellatef and Khalafallah, 2007). واضح و مبرهن است که سیتوکینینها، تقسیم سلولی را در گیاه تحریک می کنند و در از بین بردن خواب جوانههای جانبی، القا تشکیل جوانههای نابجا، رشد جوانههای جانبی و در کنترل چرخه تقسیم سلولی شرکت می کنند (Gaspar et al., 2003). غلظت مطلوب سایتوکینین باعث افزایش قابل توجه نه تنها در RNA بلکه همچنین در DNA می شود و سنتز پروتئین منجر به آغازش پریموردیای شاخه میگردد (Mok and Mok, 2001).
Ashoc وBashir (2010( نیز گزارش کردند که سیتوکینینها بر غالبیت انتهایی غلبه می کنند، باعث القاء تعداد زیادی جوانه شاخه شده و باعث از بین رفتن خواب جوانههای جانبی میشوند. بنابراین انتخاب غلظت مناسب تنظیمکننده رشد گیاهی، مرحله بحرانی در باززایی شاخه است. یافتههای این تحقیق تطابق داشت با نتایج Tiwari و همکاران (۲۰۰۰) که گزارش کردند غلظتهای بالای BAP استفاده شده در محیط باززایی، باعث ایجاد شاخه بیشتر در گیاه Centella asiatica در شرایط درون شیشه شد. Kumar و Reddy (2012) نشان دادند که با افزایش غلظت TDZ درصد تشکیل جوانههای شاخه، افزایش یافت. Feyiss و همکاران (۲۰۰۵) درگیاه Hagenia abyssinica، Kumar و همکاران a,b) 2011 (در گیاه Jatropha curcas چنین نتیجه مشابهی را مشاهده کردند. در این آزمایش، مقایسه داده های بدست آمده از تعداد جوانه القا شده و شاخه باززایی شده تفاوت معنیداری را بین سیتوکینینهای مختلف به کار برده شده نشان داد. هورمون TDZ تعداد جوانه و شاخه باززایی شده بیشتری را ایجاد کرد ولی طول شاخهها کوتاهتر بود. اثرات بازدارندگی غلظتهای زیاد TDZ در طول شاخسارهها قبلا نیز گزارش شده است (Feyissa et al., 2005; Raghu et al., 2006; Kumar et al., 2011 a,b; Kumar and Reddy, 2012). هورمون BAP نیز کارآمدتر از هورمون Kin بود. طول شاخه های ایجاد شده در محیط دارای هورمون Kin از دیگر محیطها بیشتر بود. در مطالعاتی که بر روی پرآوری گیاه Portulaca gradiflora از ریزنمونه گره در محیط کشت پایهMS تکمیل شده با غلظتهای متفاوت BAP و یا Kin انجام شد، مشاهده گردید که بهترین پرآوری شاخه در محیط MS محتوی ۴ میلیگرم در لیتر BAP صورت گرفت (Ashok and Bashir, 2010). Ahmadi Hesarو همکاران (۲۰۱۱) در آزمایشات خود بر روی اثرات غلظتهای مختلف Kin بر روی باززایی گیاه زینتی Matthiola incana مشاهده کردند که با افزایش غلظت Kin تعداد و طول شاخه های پرآوری شده افزایش یافت. TDZ از جمله مواد شبه سیتوکینینی فعال مهم است و پرآوری شاخه را در شرایط درون شیشه بیش از سایر سیتوکینینها، در بسیاری از گونه های گیاهی، القا می کند (Khawar et al., 2004). گزارش شده که اثر TDZ ممکن است به خاطر توانایی آن در تحریک تجمع سیتوکینین ( Victor et al., 1999) یا افزایش تجمع و انتقال اکسین درون بافت باشد (Murthy et al., 1998). همچنین گمان میرود که TDZ اندامزایی را در گیاهان بیشتر از طریق تلفیق اکسین و سیتوکینین درونی پیش میبرد (Gill and Saxena, 1992). Rai (2002) بیشترین شاخه پرآوری شده در گیاه Nothapodytes foetida را در محیط کشت محتوی TDZ در غلظت ۲/۲ میکرومولار بدست آورد.
Rout و همکاران (۱۹۹۹) گزارش کردند که کاربرد غلظتهای کم اکسین همراه با سیتوکینین نرخ تکثیر شاخساره را افزایش میدهد. Singh و Sehgal (1999) در آزمایشات خود روی گیاه Ocimum sanctum از ریزنمونههای گلآذین جوان در محیط MS همراه با ۱ میلیگرم در لیترBAP و ۵/۰ میلیگرم در لیتر IAA استفاده کردند. نقش BAP و IAA در تشکیل شاخه در دیگر گیاهان دارویی نیز گزارش شده است (Begum et al.,2002; Dode et al., 2003; Valdez Melare and Gatica Arias, 2009; Daniel et al., 2010). در پژوهش حاضر اضافه کردن IAA به ترکیب محیط کشت هیچ تغییر محسوسی را در میزان تولید شاخه ایجاد نکرد و حتی در بعضی تیمارها مقدار باززایی شاخه کمتر شد. علت را شاید بتوان اینگونه بیان کرد که در گیاه مریم گلی کبیرمقداری اکسین درونی وجود دارد بنابراین در محیطهای دارای تنها هورمون سایتوکینین، باززایی به خوبی صورت گرفت با اضافه کردن اکسین به محیط کشت مقدار اکسین در دسترس گیاه افزایش یافت و مقدار باززایی کمتر از محیطهای بدون اکسین بود. در تطابق با این نتایج Ishag و همکاران (۲۰۰۹) دریافتند که ترکیب NAA با BA یا Kin نسبت به استفاده از سایتوکینین به تنهایی تأثیر منفی در میزان پرآوری در گیاه گوجه فرنگی دارد. اثرات بازدارندگی اکسین در پرآوری در تعدادی از گیاهان به اثبات رسیده است. از جمله در Cotton (Abdellatef and Khalafalla, 2007)، Faba bean (Khalafalla and Hattori, 2000)، و درMung bean (Gulati and Jaiwal, 1992).
میتوان چنین نتیجه گرفت که با بهره گرفتن از تکنیک کشت بافت و با ریزنمونههای جوانههای جانبی در یک محیط مغذی حاوی سایتوکینین یا ترکیب سایتوکینین و اکسین مناسب، میزان و سرعت تکثیر شاخه می تواند به میزان زیادی افزایش یابد.
۴-۵- اثر ترکیبات مختلف تنظیمکننده های رشد گیاهی بر ریشهزایی
در این آزمایش بیشترین میانگین تعداد ریشه در محیط کشت MS و یا MS ½ حاوی ۵/۰ میلیگرم در لیتر IAA بدست آمد. غلظتهای مختلف MS تفاوت معنیداری را در میانگین تعداد ریشه نشان ندادند. ریشهزایی در محیطهای دارای هورمون IAA بهتر از محیطهای دارای هورمون IBA صورت گرفت. بین محیط شاهد و سایر محیطها تفاوت معنیداری مشاهده نشد. حتی ریشهزایی در محیط شاهد بهتر از محیط های دارای IBA روی داد. همانطور که قبلا نیز ذکر شد احتمال میرود سطح اکسین درونی در گیاه مریمگلیکبیر بالا باشد و به همین علت یک گیاه علفی و سهل ریشه زا است و ریشهزایی می تواند در محیط کشت بدون اکسین انجام گیرد. اکسینها هورمونهای مهمی برای ریشهزایی هستند (Vuylasteker et al., 1998; Nandagopal and Ranjitha Kumari, 2007). اکسین مراحل پیچیده تشکیل ریشه جانبی (Lateral) را از طریق تکرار تقسیم سلولی القا می کند (Liu et al., 2002). در مقایسه اندازه طول ریشه های بدست آمده، مشاهده گردید که طول ریشهها در محیط شاهد بیشتر از سایر محیطها بود و این نتیجه دور از انتظار نبود زیرا همانطور که میدانیم اکسینها باعث القای ریشه میشوند ولی پس از آن از رشد ریشه جلوگیری می کنند بنابراین با کاربرد اکسین خارجی، القای ریشه صورت گرفت ولی به علت تجمع اکسین زیاد در گیاه، رشد طولی ریشهها نسبت به محیط شاهد کمتر بود.Lameira وPinto (2006) مشاهده کردند که ریشهزایی شاخه های باززایی شده در گیاه دارویی Cordia verbenacea L. در محیط MS بدون تنظیمکنندهرشد روی داد. Zhang و همکاران (۲۰۱۱) اذعان داشتند که اگر چه شاخه های حاصل از پرآوری در گیاه Codonopsis pilosula میتوانند به طور خودبخودی در محیط MS ½ بدون هورمون، ریشه تولید کنند، کاربرد اکسین برای انگیزش بیشتر ریشه لازم بود.
موفقیت هر پروتکل کشت بافت بستگی به سازگاری موفق گیاهچههای بدست آمده از کشت درون شیشه ای در شرایط گلخانه و مزرعه دارد (Nalawade and Tsay, 2004). درتحقیق حاضر گیاهچههای حاصل از کشت بافت، پس از سازگاری با ۹۰ درصد زندهمانی به شرایط گلخانه منتقل شدند.
۵-۵- نتیجه گیری کلی