زرین دشت
نیریز
استهبان
شکل۳-۱-نمایی از عکس هوایی منطقه های جمع‌ آوری آنغوزه
۳-۲-استخراج اسانس
۳-۲-۱-مواد و وسایل لازم
کلونجر، هیتر، ان هگزان، سولفات سدیم، سرنگ همیلتون، ظروف شیشه‌ای تیره جهت نگهداری اسانس.
۳-۲-۱-۲- روش کار
۵۰ گرم پودر خشک و آسیاب شده از هر گیاه رویش یافته در سه منطقه استهبان، زرین دشت و نیریز، به صورت جداگانه داخل سه بالن (هرکدام ۲۰۰۰ میلی‌لیتری) ریخته شد و به هر کدام از بالن‌ها به ترتیب ۵۰۰ میلی‌لیتر آب اضافه شد تا سطح پودر با آب مقطر پوشانده شد. بالن به دستگاه اسانس‌گیری وصل و توسط حرارت آب بالن به جوش آمد و به مدت ۳- ۴ ساعت اسانس‌گیری انجام گرفت (نیک آور، ۱۳۸۳). اسانس‌ها پس از آب‌گیری توسط سولفات سدیم بدون آب، توسط سرنگ به درون ویال شیشه‌ای ریخته شد، برای خارج شدن ان هگزان از اسانس، از هوای خنک سشوار به مدت ۳ دقیقه استفاده شد. اسانس تا زمان آنالیز در ویال شیشه‌ای قرار گرفت، درِ شیشه‌ها با پارافیلم پیچیده شد و سپس ویال‌ها در فویل آلومینیومی پیچیده و در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد نگهداری شد (Mewes. et al., 2008). عمل اسانس‌گیری برای هر نمونه ۳ بار تکرار گردید. مقادیر بر اساس درصد وزنی به وزنی محاسبه شد و با عنوان درصد اسانس^[۸] گزارش گردید. شکل ۱-۳ مراحل اسانس‌گیری را نشان می‌دهد(شکل ۳-۲).

شکل ۳-۲- نمایی از جمع‌ آوری شیره آنغوزه
شکل ۳-۳- نمایی از مراحل اسانس گیری

• آنالیز اسانس

میزان هر ترکیب در اسانس گیاهان توسط دستگاه گاز کروماتوگرافی (GC) مشخص شد و نوع ترکیب‌های موجود در اسانس با بهره گرفتن از دستگاه گاز کروماتوگرافی و جرم سنجی (GC/MS) با بهره گرفتن از کتابخانه موجود در دستگاه مشخص گردید. میزان ترکیبات و نوع هر ترکیب با بهره گرفتن از ضریب بازدارندگی و شاخص کواتز برای هر ترکیب مشخص شد.

• مشخصات دستگاه گاز کروماتوگرافی جهت تعیین مقدار ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس

به منظور تعیین مقدار ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس، از دستگاه گاز کروماتوگراف مدلAgillent Technologist مدل ۶۸۹۰، مجهز به ستون DB-5با طول ۳۰ متر و قطر داخلی ۲۵/۰ میلی‌متر و ضخامت ۲۵/۰ میلی‌متر با برنامه‌ریزی دمایی اولیه ستون ۶۰ درجه سانتی‌گراد به مدت ۵ دقیقه با سرعت افزایش دمای ۳ درجه سانتی‌گراد در دقیقه، دمای محفظه تزریق ۲۴۰ درجه سانتی‌گراد و دمای محفظه آشکارساز ۲۵۰ درجه سانتی‌گراد استفاده شد.
۳-۵- مشخصات دستگاه طیف سنج جرمی جهت شناسایی ترکیب‌های تشکیل دهنده اسانس
جهت شناسایی ترکیب‌های موجود در اسانس از دستگاه GC/MS مدلHewllet-packard (6890serries) با ولتاژ یونیزاسیون ۷۰ الکترون ولت مجهز به ستون DB-5 به طول ۳۰ متر و قطر داخلی ۲۵/۰ میلی‌متر و برنامه حرارتی مشابه برنامه حرارتی دستگاه GCبرای شناسایی ترکیب‌های موجود در اسانس استفاده گردید. از گاز هلیوم به عنوان گاز حامل استفاده شد و دمای محفظه تزریق ۱۴۰ درجه سلسیوس بالاتر از دمای نهایی ستون تنظیم شده بود. تزریق اسانس با بهره گرفتن از روش Split با نسبت ۵۰/۱ انجام گردید.
۳-۶- آنالیز داده‌ها
گروه بندی میانگین‌ها با آزمون چند دامنه‌ای دانکن در سطح ۱% و ۵% انجام شد. برای رسم نمودارها و جدول‌ها از نرم افزار اکسل ۲۰۱۰^[۹] در مجموعه آفیس استفاده شد.
۳-۷- عصاره‌گیری و اندازه گیری ترکیبات فنلی و آنتی اکسیدان
۳-۷-۱- اندازه‌گیری ترکیبات فنلی
۳-۷-۱-۱- مواد و وسایل لازم
گیاه خشک شده، استون، فولین، سدیم‌کربنات، اسپکتروفوتومتر، لوله آزمایش، سرنگ همیلتون،. کامپیوتر, دستگاه HPLC مدل AGILENT سری ۱۲۰۰، ارلن، کاغذ صافی، بالن ژوژه، آسیاب برقی، روتاری مدل RV10basic ، ظروف مخصوص نگه داری عصاره تر و خشک، یخچال، میکروتیوب، اسپاتول، سمپلر، سرسمپلر، ترازوی سه صفر و چهار صفر، میکروپلیت، میکروپلیت ریدر مدل ELx808شرکت Biotek، پلیت، پیپت، پوآر، سل کوارتز، ورتکس، فویل، بشر(شکل ۳-۴ ، ۳-۵، ۳-۶، ۳-۷).
شکل (۳-۴) دستگاه میکروپلیت‌ریدر
شکل۳-۵ وسایل مورد نیاز آزمایش
شکل (۳-۶): استفاده از نرم‌افزار ویژه دستگاه میکروپلیت‌ریدر
شکل (۳-۷): دستگاه روتاری
۳-۷-۱-۲-اندازه گیری پلی فنل توسط دستگاه HPLC
۳-۷-۱-۲-الف مواد مورد نیاز آزمایش
حلال متانول مرک، نمونه‌های خشک و پودر شده گیاهی، استیک اسید، گالیک اسید، DPPH، کلروجنیک اسید، سینامیک اسید، کافئیک اسید(شکل ۳-۸).

شکل (۳-۸): بخشی از مواد و وسایل بکار رفته در آزمایش
۳-۷-۱-۲-ب- تهیه عصاره‌های گیاهی
پس از خشک کردن نمونه‌های گیاهی در هر مرحله از آزمایش، نمونه‌ها توسط آسیاب برقی آسیاب (پودر) شد. ده گرم از این نمونه‌های پودر شده درپنجاه میلی‌لیتر، حلال متانول به مدت ۴۸ ساعت خوابانده و با کاغذ صافی، عصاره‌گیری انجام شد. این عصاره‌ها را در روتاری تغلیظ و جهت اندازه گیری فنل کل، کاملاً خشک(بدون حلال) در ظروف مخصوص ریخته شد و دور آن را فویل آلومینیومی پیچیده و در یخچال نگهداری شد.
۳-۷-۱-۲-ج- غلظت سازی عصاره‌ها