طول ساقه و ریشه با بهره گرفتن از خط کش بر اساس سانتی متر اندازه گیری گردید. برای هر گروه تیماری سه تکرار در نظر گرفته شد و محاسبه میانگین بر اساس واحد سانتی‌متر گزارش گردید.

۳-۴ مطالعات بیوشیمیایی
۳-۴-۱ سنجش فعالیت آنزیم‌ها
۳-۴-۱-۱ تهیه عصاره گیاهی
برای تهیه ۵۰ میلی‌لیتر بافر استخراج، ۶۰۷/۰ گرم تریس را با ۰۵/۰ گرم PVP در ۴۰ میلی‌لیتر آب مقطر به‌خوبی حل کرده و سپس با اسیدکلریدریک pH محلول را به ۸ رسانده و بعدازآن محلول را به حجم نهایی ۵۰ میلی‌لیتر می‌رسانیم و از این بافر برای عصاره گیری پروتئین و آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی استفاده می‌کنیم (این محلول باید در یخچال نگهداری شود). جهت عصاره گیری، ابتدا ۵/۰ گرم نمونه برگ را در ازت مایع کاملاً خرد می‌نماییم، سپس ۲ میلی‌لیتر بافر فوق را به آن اضافه نموده و در داخل هاون چینی کاملاً هموژنیزه می‌کنیم. مخلوط حاصل را در لوله اپندورف و به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ نموده و پس‌ازآن فاز بالایی جهت قرائت میزان پروتئین و فعالیت آنزیم‌ها جدا می‌گردد.
۳-۴-۱-۲ استخراج پروتئین
۳-۴-۱-۲-۱ روش اندازه‌گیری میزان پروتئین کل
برای تعیین غلظت پروتئین از روش برادفورد^[۸] استفاده شد. مبنای این‌روش بر اساس اتصال رنگ کو ماسی بلو G250 موجود در معرف اسیدی به مولکول پروتئین است. جهت تهیه معرف، مقدار ۰۱/۰گرم کو ماسی بلو G250در ۵ میلی‌لیتر اتانول ۹۶ درصد با کمک همزن مغناطیسی (مگنت) در تاریکی به‌خوبی حل گردیده و سپس ۱۰ میلی‌لیتر اسید فسفریک ۸۵ درصد را قطره‌قطره به مخلوط فوق اضافه کرده و پس از هم زدن، حجم نهایی محلول با آب مقطر به ۱۰۰ میلی‌لیتر رسانده می‌شود. برای اندازه‌گیری ­ غلظت پروتئین ۲۰ میکرو لیتر عصاره استخراج‌شده را در ۸۰ میکرو لیتر بافر استخراج رقیق کرده و ۵ میلی‌لیتر معرف کو ماکسی به لو تازه به آن افزوده و ۲ دقیقه به هم زده و پس از ۵ دقیقه، میزان جذب نوری آن در طول‌موج ۵۹۵ نانومتر قرائت می‌گردد؛ و از بافر استخراج به‌عنوان شاهد استفاده می‌شود. غلظت پروتئین در نمونه با توجه به جذب نمونه و با بهره گرفتن از منحنی استاندارد به دست می‌آید.
۳-۲-۱-۲-۲ رسم منحنی استاندارد
جهت رسم منحنی استاندارد ازسرم آلبومین گاوی (BSA) استفاده گردید؛ و برای رسم آن ابتدا ۱۰ میلی‌گرم سرم آلبومین گاوی را داخل ۱۰ میلی‌لیتر از بافر استخراج حل می‌گردد. (این محلول به‌عنوان محلول ۱۰۰ درصد در نظر گرفته می‌شود). برای ساختن محلول ۵۰ درصد، ۵ میلی‌لیتر از محلول ۱۰۰ درصد را با ۵ میلی‌لیتر بافر استخراج مخلوط می‌نماییم. در مرحله بعد ۵ میلی‌لیتر از محلول ۵۰ درصد را با ۵ میلی‌لیتر بافر استخراج مخلوط می‌کنیم (محلول ۲۵ درصد) برای ساختن محلول ۵/۱۲درصد، ۵ میلی‌لیتر از محلول ۲۵ درصد را با ۵ میلی‌لیتر بافر استخراج مخلوط می‌نماییم و از بافر استخراج برای محلول صفر استفاده می‌نماییم. در مرحله بعد، از هر لوله‌آزمایش ۲۰ میکرو لیتر محلول برداشته‌شده و در ۸۰ میکرو لیتر بافر استخراج رقیق کرده و در داخل هر یک از لوله‌ها ۵ میلی‌لیتر معرف رنگی ریخته و به مدت ۲ دقیقه با ورتکس به هم زده و بعد از ۵ دقیقه در داخل دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده و میزان جذب نوری آن در طول‌موج ۵۹۵ نانومتر قرائت می‌گردد. سپس با توجه به مقادیر جذب نوری و غلظت های محلول ذخیره پروتئین منحنی استاندارد رسم می‌گردد (قابل‌ذکر است که ضریب تبیین) ^۲Rمنحنی نباید کمتر از ۹۸ درصد باشد).
پروتین میلی گرم
شکل۳-۱ نموداراستاندارد پروتئین
۳-۲-۱-۳ اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز (APX)
برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش ناکان و آسادا^[۹] استفاده شد. بر اساس این‌رو ۵۰ میکرولیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر محلول اندازه‌گیری اسکوربیک پراکسیداز که شامل ۵۰ میلی مول بافر فسفات پتاسیم (۷=pH)، ۱/۰ میلی مول EDTA، ۵/۰ میلی مولا اسید اسکوربیک (ASA) و ۱۵/۰ میلی مولا پراکسیداز هیدروژن (H₂O₂) است مخلوط می‌کنیم. سپس جذب آن را در طول‌موج nm290 بعد از مدت یک دقیقه با دستگاه اسپکتوفتومتری می‌خوانیم. یک واحد آنزیمی اسکوربیک پراکسیداز برابر با تجزیه یک میلی مولار اسید اسکوربیک در یک دقیقه است.
۳-۲-۱-۴ اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیم کاتالاز (CAT)
برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش دهیندزا^[۱۰] استفاده شد. بر اساس این‌ روش ۵۰ میکرو لیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر محلول اندازه‌گیری کاتالاز که شامل ۵۰ میلی مول بافر فسفات پتاسیم (۷=pH) و ۱۵ میلی مول پراکسیداز هیدروژن (H₂O₂) است مخلوط می‌کنیم. سپس جذب آن را در طول‌موج nm240 به مدت یک دقیقه با دستگاه اسپکتوفتومتری می‌خوانیم. یک واحد آنزیمی کاتالاز برابر با تجزیه یک میلی مولا پراکسیداز هیدروژن (H₂O₂) در یک دقیقه است.
۳-۲-۱-۵ اندازه‌گیری میزان فعالیت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (SOD)
برای اندازه‌گیری میزان فعالیت کمی این آنزیم از روش بیچامپ و فریدوویچ^[۱۱] استفاده شد. اندازه‌گیری بر اساس توانایی آنزیم SOD در متوقف کردن احیاﺀ فتوشیمیایی نیتروبلوتترازولیوم (NBT) ‌ توسط رادیکالهای سوپر اکسید در حضور ریبوفلاوین در نور صورت می‌گیرد. بر اساس این ‌روش ۵۰ میکرو لیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر محلول اندازه‌گیری سوپر اکسید دیسموتاز که شامل ۵۰ میلی مول بافر فسفات پتاسیم (۸/۷=pH)، ۷۵ میکرومولار NBT، ۱۳ میلی مولار الف- متیونین، ۱/۰ میلی مولار EDAT و ۲ میکرومولار ریبوفلاوین است مخلوط می کنیم. لازم به ذکر است که محلول ریبو فلاوین را باید به‌صورت جداگانه و در ظرف تیره نگهداری نمود و پس از اضافه کردن عصاره استخراج و محلول اندازه‌گیری سوپر اکسید دیسموتاز آن را به کیووت اضافه می‌کنیم. جهت انجام واکنش این مخلوط به مدت ۱۵ دقیقه در اتاقک نور قرار می­دهیم. سپس محلول حاصل را در دستگاه اسپکتروفتومتر قرار داده و میزان جذب نوری آن در طول‌موج nm560 قرائت می‌کنیم.
۳-۲-۱-۶ فعالیت آنزیمی پراکسیداز
برای اندازه‌گیری میزان غلظت کمی این آنزیم از روش چانس و ماهلی^[۱۲] با اندکی تغییرات استفاده شد. اندازه‌گیری بر اساس میزان اکسید شدن گوایکول توسط این آنزیم انجام می‌گیرد. در این روش ۳۳ میکرو لیتر از عصاره استخراج را با یک میلی‌لیتر از محلول پراکسیداز که شامل ۱۳ میلی مولار گوایکول، ۵ میلی مولار پراکسیداز هیدروژن (H₂O₂) و ۵۰ میلی مولار بافر فسفات پتاسیم (۷= pH)است مخلوط نموده و به مدت یک دقیقه با فواصل ۱۰ ثانیه در طول‌موج nm 470 جذب آن را می‌خوانیم. برای ساختن ۱۰۰ میلی‌لیتر بافر فسفات پتاسیم، ۳۹ میلی‌لیتر فسفات پتاسیم مونو بازیک ۵۰ میلی مولار را با ۶۱ میلی‌لیتر فسفات پتاسیم دی بازیک ۵۰ میلی مولار ترکیب می‌کنیم.
۳-۲-۱-۷ اندازه‌گیری پرولین
برای اندازه‌گیری غلظت پرولین از روش بیتز^[۱۳] و همکاران استفاده شد. بر اساس این‌رو ۵/۰ گرم برگ، از هر نمونه را در ۱۰ میلی‌لیتر محلول آبی اسید سولفوسالیسیلیک ۳ درصد قرار داده و مخلوط حاصل در هاون چینی کاملاً هموژنیزه می‌گردد. سپس مخلوط هموژنیزه شده توسط کاغذ صافی واتمن شماره ۲ صاف می‌شود. در مرحله بعد ۲ میلی‌لیتر از این محلول را با ۲ میلی‌لیتر معرف نین هیدرین (برای تهیه این معرف ۲۵/۱ گرم نین هیدرین را در ۳۰ میلی‌لیتراسید استیک و ۲۰ میلی‌لیتر اسید فسفریک ۶ مولار حل می‌کنند) مخلوط نموده و ۲ میلی‌لیتر اسید استیک به هر لوله اضافه می‌شود. سپس نمونه‌ها به مدت یک ساعت در حمام بن ماری در دمای ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد قرار داده، و بلافاصله پس از خارج کردن از حمام به مدت چند دقیقه در حمام یخ قرار داده می‌شوند. بعدازاین مرحله به هر لوله‌آزمایش ۴ میلی‌لیتر تولوئن اضافه کرده و نمونه‌ها باهم زن^[۱۴] به مدت ۲۰- ۱۵ ثانیه به هم زده‌شده تا کاملاً یکنواخت شوند. سپس لوله‌ها برای مدتی در محیط آزمایشگاه قرار داده می‌شوند. در این مدت در داخل لوله‌آزمایش ۲ فاز رویی و زیرین کاملاً از هم قابل‌تشخیص شده و از فاز رویی برای تعیین غلظت پرولین با توجه به منحنی استاندارد پرولین در دستگاه اسپکتروفتومتر در طول‌موج ۵۲۰ نانومتر استفاده می‌گردد.
برای رسم منحنی استاندارد پرولین از غلظت‌های ۱۰۰، ۵۰، ۲۵، ۵/۱۲و صفر میکرو مولار (µM) از ال - پرولین استفاده کرده و از تولوئن به‌عنوان شاهد (سطح صفر) استفاده می‌شود. (انجام بقیه مراحل مانند رسم منحنی استاندارد پروتئین کل است که قبلا توضیح داده شد). بعد از ساختن محلول­های استاندارد باید به لوله های آزمایش به‌جای عصاره برگ، هر یک از محلول های استاندارد صفرتا صد اضافه شود و بقیه مراحل مانند روش اندازه‌گیری پرولین (در بالا شرح داده شد) صورت می‌گیرد؛ و با توجه به مقادیر جذب نوری و غلظت‌های محلول ذخیره، منحنی استاندارد رسم می‌گردد؛ و برای محاسبه پرولین از رابطه زیر استفاده می‌شود.
Proline (µM g^-1 fresh wt.) × ۱۰۰۰
که در آن
= M عدد قرائت‌شده با دستگاه اسپکتروفتومتر.
=T حجم تولوئن مورداستفاده (در اینجا ۴ میلی‌لیتر است).
=W وزن نمونه برگی مورداستفاده (برای نمونه های ما برابر ۵/۰ است).
۳-۲-۲ تجزیه‌وتحلیل آماری
جهت تجزیه‌وتحلیل دادهای حاصل از آزمایش از نرم‌افزار آماری SPSS و برای مقایسه میانگین از آزمون دان کن استفاده شد.
۳-۳- مطالعات مولکولی
۳-۳-۱ استخراج RNA
۳-۳-۱-۱استخراج RNA با روش ترایزول
برای استخراج RNA از برگ و ریشه از معرف ترایزول که حاوی گوانیدین ایزوسیانات است، استفاده گردید (Invitrogen). در ابتدا به‌منظور عاری نمودن محلول­ها ازنظر وجود آنزیم RNase از معرف DEPC استفاده گردید. روش استخراج بر اساس دستورالعمل کیت خریداری‌شده به شرح زیر صورت گرفت. ابتدا بافت برگی با بهره گرفتن از نیتروژن مایع در هاون پودر گردید سپس محلول ترایزول به‌منظور لیز کردن سلول ها و دناتوره کردن پروتئینها و غیرفعال نمودن نوکلئازها به مقدار یک میلی‌لیتر به ازای ۱/۰ گرم برگ اضافه گردید و مخلوط حاصل به‌خوبی ورتکس شد تا هموژن شود و سپس به مدت ۵ دقیقه در دمای محیط قرار گرفت. سپس ۲/۰ میلی‌لیتر کلروفورم به ازای هر ۱ میلی‌لیتر ترایزول اضافه شد و برای ۱۵ ثانیه با دست به‌شدت تکان داده شد و بعدازآن به مدت ۳-۲ دقیقه در دمای محیط انکوبه گردید. نمونه­های برای ۱۵ دقیقه در دمای ۴ درجه سانتی‌گراد با دور g 12000 سانتریفیوژ گردیدند. پس از تشکیل دو فاز کاملاً مشخص، فاز بالائی که شفاف و حاوی RNA بود با دقت جمع‌ آوری‌شده و به یک تیوپ جدید منتقل گردید و برای رسوب RNA مقدار ۵۰۰ میکرو لیتر ایزوپروپانل سرد اضافه شد و ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفت. پس‌ازآن، RNA به‌صورت رسوب سفیدرنگ در انتهای تیوب قابل‌مشاهده است و سپس محلول بالائی دور ریخته شد و ۳ مرتبه با الکل ۷۰% شستشو داده شد. نمونه‌ها برای ۱۰ دقیقه خشک‌شده و به آن آب تیمار شده با DEPC اضافه گردید و جهت حل شدن RNA، نمونه­های به مدت ده دقیقه در دمای ۶۰-۵۵ درجه سانتی‌گراد قرار گرفتند.
۳-۳-۲-۱ بررسی کیفیت و کمیت RNA استخراج‌شده
۳-۳-۲-۲ الکتروفورز
برای تعیین کیفیت RNA استخراج‌شده عمل الکتروفورز انجام گردید. برای این منظور از الکتروفورز ژل آگارز ۲/۱% با ولتاژ ثابت ۶۵ ولت استفاده شد. نتایج الکتروفورز RNA برای مشاهده توسط اتیدیوم برومید رنگ‌آمیزی و توسط دستگاه ژل داکیومنت مشاهده گردید.
۳-۳-۲-۳ اسپکتروفوتومتری
RNA با توجه به ساختار آن، حداکثر جذب را در طول‌موج nm 260 دارا هست. بر اساس ضریب جذب تراکم اپتیکال (OD) برابر ۱ در طول‌موج nm 260، معادل با غلظت تقریبی µl/ml 40 از RNA تک رشته‏ای است. نسبت OD₂₆₀ به OD₂₈₀، درجه خلوص RNA را مشخص می‏نماید که این نسبت تقریبا بایستی در محدوده ۸/۱-۱/۲ باشد. در صورت وجود آلودگی های پروتئینی این نسبت کاهش می‏یابد. نسبت OD₂₆₀ به OD₂₃₀ میزان آلودگی به مواد فعلی و پلی‏ساکاریدی را نشان می‏دهد. حداقل ابن نسبت برای اطمینان از عدم آلودگی به مواد مذکور ۲ هست. مراحل کمیت سنجی RNA به شرح زیر انجام شد:
برای اندازه‏گیری غلظت RNA ابتدا دستگاه اسپکتروفوتومتر با µl 190 آب مقطر دیونیزه، استاندارد شد. سپس µl 10 از RNA استخراج‌شده از برگ و ریشه گیاه به کیووت دستگاه تزریق و همگن شد. سپس میزان جذب نوری نمونه­ها در طول‌موج ها یادداشت شدند.
۳-۳-۳- تیمار نمونهمای RNA استخراج‌شده با آنزیم DNase
به‌منظور حذف آلودگی DNA ژنومی از RNA های استخراجی، تیمار با آنزیم DNaseI (Fermentase) به روش زیر انجام شود:
میزان RNA موردنیاز جهت ساخت cDNA به همراه آنزیم DNaseI که حجم آن مساوی با میکرو‏گرم RNA است با بافر واکنش مخلوط و سپس با آب عاری از RNase به حجم رسانده شد. این مخلوط به مدت نیم ساعت در دمای ᵒc 37قرار داده شد پس از اتمام واکنش برای غیرفعال کردن آنزیم، به واکنش هم‌حجم آنزیم مصرفی EDTA 50 میلی‌متری عاری از RNase اضافه‌شده و پس از مخلوط کردن به مدت ده دقیقه در دمای ۶۵ᵒc قرار داده شد.
جدول ۳-۱- مواد بکار رفته و مقادیر آن در تیمار با آنزیم DNase I