بافر آنزیم DNA پلیمراز C7507CG سیناژن
مخلوط نوکلئوتیدها mM10 C7604DN سیناژن
پرایمر سنس و آنتی سنس GAPDH, GLT1
Mgcl2 mM50 C7506TP سیناژن
mg/ml DNA Safe10 881603 PR سیناژن
DNA Ladder (bp100) سیناژن
بافر الکتروفورز X TBE) 5/0(
توالی و طول قطعه پرایمرها در زیر بیان شده است [۲۷۴].
GLT1-F: 5′CCTCATGAGGATGCTGAAGA3‘
GLT1-R: 5′ TCCAGGAAGGCATCCAGGCTG3′
Size: 258 bp
GAPDH-F: 5′CCCTGTTGCTGTAGCCGTATTC3
GAPDH-R: 5′TGACATCAAGAAGGTGGTGAAGC3′
Size: 203 bp
روش کار:
مخلوط واکنش شامل cDNA 2 میکرولیتر، MgCl2 ۷۵/۰ میکرولیتر با غلظت نهایی ۷۵/۰ میلی مولار، بافر آنزیم DNA پلیمراز ۵/۲ میکرولیتر، آنزیم DNA پلیمراز ۱۲۵/۰ میکرولیتر، مخلوط نوکلئوتیدها ۵/۰ میکرولیتر، پرایمر سنس و آنتی سنس برای هر ژن با غلظت نهایی ۵/۰ میکرومولار بود.
بعد از دناتوره شدن اولیه در دمای ۹۴ درجه به مدت دو دقیقه PCR طبق برنامه زیر اجرا شد:
ژن GLT1:
دناتوره شدن[۱۷۹] در دمای ۹۴ درجه ۱۵ ثانیه
انلینگ[۱۸۰] در دمای ۶۲ درجه ۱ دقیقه
سنتز[۱۸۱] در دمای ۷۲ درجه ۱ دقیقه
این برنامه در مجموع با ۲۹ چرخه انجام شد و پس از اتمام چرخهها، واکنش نهایی سنتز به مدت ۲ دقیقه ۷۲ درجه انجام شد.
ژن GAPDH:
دناتوره شدن در دمای ۹۴ درجه ۱۵ ثانیه
انلینگ در دمای ۵۵ درجه ۳۰ ثانیه
سنتز در دمای ۷۲ درجه ۱ دقیقه
این برنامه در مجموع با ۳۰ چرخه انجام شد و و بعد از اتمام چرخهها، واکنش نهایی سنتز به مدت ۲ دقیقه ۷۲ درجه انجام شد.
الکتروفورز
مخلوط ۱۰ میکرولیتر از محصول PCR با ۲ میکرولیتر بافر لودینگ بر روی ژل آگارز ۵/۱ در صد الکتروفورز شد (بافر TBE غلظت نهایی X5/0 ، ولتاژ V100 ، زمان ۳۰ دقیقه). ژل با دستگاه نمایشگر ژل(UVI doc) مشاهده شد.در این تحقیق از GAPDH به عنوان ژن کنترل استفاده شد. میزان نسبی تکثیر هر یک از ژنها توسط نرم افزار Image J اندازه گیری شد. برای تعیین میزان نسبی تکثیر ژنها، شدت باند هر یک از ژنها نسبت به شدت باند ژن GAPDH سنجیده شد.
مطالعه بیوشیمیایی
فعالیت آنزیمهای آنتی اکسیدانت سوپر اکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز در هیپوکمپ تعیین گردید، و همچنین برای بررسی لیپید پراکسیداسیون جهت ارزیابی استرس اکسیداتیو، از اندازه گیری میزان مالون دی آلدئید تولید شده در فرایند لیپید پراکسیداسیون استفاده شد. همچنین فعالیت آنزیم گلوتامین سنتتاز در هیپوکمپ تعیین گردید.
جهت سنجش آنزیمها ابتدا بافت هیپوکمپ با ml 1 بافر پتاسیم فسفات (۲/۷pH=، mM10) هموژنه گردید. سپس بافت لیز شده به مدت ۱۵ دقیقه و با دور ×g10000 در دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفوژ شد و از سوپرناتانت بافت (محلول رویی) جهت سنجش آنزیم استفاده گردید.
فعالیت سوپر اکسید دیسموتاز(SOD) [۲۷۵]
فعالیتSOD بر اساس جلوگیری از احیا فتوشیمیایی Nitroblu Tetrazolium(NBT) سنجیده شد.
روش کار:
ابتدا مواد واکنش به ترتیب زیر آماده گردید:
پژوهش – بررسی اثر محافظتی یوژنول در مقابل سمیت ناشی از هایپرآمونیا در هیپوکمپ موش …