جدول۴-۶ عصارهغلیظشدهاسفنجدریاییsp.Callyslpongia 36
فهرست تصویر و نمودارها
عنوان صفحه
تصویر ۳-۱ محلنمونهبرداری ۱۳
تصویر۳-۲ اسفنجدریاییCallyslpongia sp. ازجزیرههرمزخلیجفارس ۱۴
تصویر ۳-۳ اسفنجخیسشدهدرحلالوفازمیانیایجادشده ۱۵
تصویر۳-۴ محلولعصارهگیریبعدازفیلترکردنباکاغذصافیواتمنشماره ۱ ۱۵
تصویر ۳-۵ دستگاهروتاریHeidolph مدلLaboreta 4011digital 15
تصویر۳-۶ عصارهاسفنچبعدازتبخیرحلالبااستفادهازدستگاهروتاری ۱۶
تصویر۳-۷محیطکشتاستافیلوکوکوساورئوس ۱۷
تصویر ۳-۸ محیطکشتاشریشاکلای ۱۷
تصویر ۳-۹ محیطکشتشیگلا ۱۷
تصویر ۳-۱۰ اسفنجپودرشدهبااستفادهازنیتروژنمایع ۱۹
تصویر ۳-۱۱ مقایسهمحلولهایمیکروبی ۵/۰ مکفارلندوکلریدباریم ۲۲
تصویر۳-۱۲رقتهایمختلفعصارهاسفنجCallyslpongia sp. 24
تصویر ۳-۱۳ دستگاهاسپکتروفتومتریمدلUnico uv-1200 24
تصویر۳-۱۴کلنیهایایجادشدهدرمحیطکشتمیکروبی ۲۶
تصویرشماره ۴-۱مارکرco1 28
تصویرشماره۴-۲ محدودهیباندهایPCR 28
تصویر ۴-۳خاصیتباکتریواستاتیکیعصارهE بر S.aureus 29
 ۲۹
 ۳۰
 ۳۰
 ۳۰
 ۳۱
نمودار۴-۱ حداکثرقطرهالهممانعتازرشدمیکروبیعصارهاسفنجCallyslpongia sp. 35
نمودار ۴-۲ مقدار MICباکتریاشریشاکلای ۳۷
نمودار ۴-۳ مقدار MICباکتریشیگلا ۳۷
نمودار ۴-۴ مقدارMICباکتریاستافیلوکوکوساورئوس ۳۸
فصل اول
مقدمه و کلیات
۱-۱ مقدمه
۱-۲ معرفی اسفنج
اسفنج های دریایی متعلق به سلسله یAnimaliشاخه ی Porifera زیر شاخه ی Celdulariaکه دارای رده هایCaleareaوGlassspongeوDemospongiaeمی باشندتا کنون بیش از هشت تا ده هزار گونه اسفنج دریایی شناسایی شده اند (Dhinakaranand Lipton, 2012).
اسفنج ها جانوران پرسلولی بدون ریشه متصل به بستر دریاها و فاقد لایه یا اندامک بافتی هستندآنهاجانورانی هستند که در محیط های دریایی از قطبی تا معتدل و استوایی یافت می شوند البته در نواحی قطبی در صخره های مرجانی فراوان تر می باشند. این موجودات با فیلتر کردن آب دریا از باکتری و میکروارگانیسم های دریایی تغذیه میکنند همچنین برخی از میکروارگانیسم ها با اسفنج زندگی همزیستی دارندو تا ۴۰ درصد زیست توده ی اسفنج را در بر می گیرند که ممکن است تراکم آنهابه بیش از ۲تا ۳ برابر تعداد باکتری هایی که در حجم مشخصی از آب دریاموجود باشند برسند.اسفنج ها حجم زیادی از آب را با روند صافی خواری از سیستم عروقی وکانالی منحصر به فردخود پمپ می کننداز طریق فاگوسیتوز باکتریو مواد مغذی را از ستون آب جذب می کنند.از آنجایی که آب دریا به طور متوسط محتویباکتری در میلی لیتر می باشد، مشکلات گرفتگی منافذ سیستم کانالی، فرم های بیوفیلم و فولینگ بر سطح اسفنج وجود ندارند(Thakur et al., 2003).
اسفنج ها مرفولوژیک و مکانیسم دفاع سلولی خاص ندارند و کمتر با میکروب بیماریزا آلوده می شوند (Newbold et al., 1999 ) به همین دلیل موفق ترین جانوران بنتیک از ۸۰۰ میلیون سال پیش تاکنون می باشند (Dhinakaran and Lipton,2012).
۱-۳ اسفنج و میکروارگانیسم های همزیست
اسفنج ها میزبان تعداد زیادی از ۲۶ شاخه باکتری کشف شده در مطالعات اخیر می باشند.میکروب هامی توانند ۵۰ تا ۶۰ در صد زیست توده اسفنج میزبان را در اختیار گیرند و از این طریق در به دست آوردن مواد غذایی،سوخت وساز،تثبیت اسکلت اسفنج،پردازش مواد زاید و تولید متابولیست ثانویه نقش مهمی راایفا کنند. شواهد اخیر نشان داده اند که مواد فعال زیستی نتیجه تعامل مشترک بین اسفنج و میکروارگانیسم همزیست آنها می باشند(Zeng et al., 2013). باکتری هایی که بر سطح اسفنج ها زندگی می کنند از لحاظ دسترسی به مواد غذایی و محیط زندگی با هم در رقابت هستند. تولید متابولیت های ثانویه بوسیله ی باکتری های همزیست اسفنج بیشتر از تولیدباکتری های پلانکتونی است.چندین ترکیب با خواص درمانی مشخص و بالقوه از اسفنج ها بدست آمده که شباهت قابلتوجهی با متابولیت های میکروارگانیسم های مرتبط با آنها دارند از این رو باکتری های همزیست اسفنج یک منبع بسیار فعال برای تولید آنتی بیوتیک ها محسوب می شوند (Devi et al., 2010 ).

۱-۴ اهمیت کاربرد ارگانیسم های دریایی
افزایش کاربردآنتی بیوتیک های خاص در پزشکی،دامپزشکی،کشاورزی، وجود مشکلات فراوان در بیماری های مشترک انسان و دام،مقاومت استافیلوکوکوس اورئوس به متی سیلین^[۱](MRSA)، مقاومت استافیلوکوکوس پنومونیه به پنی سیلین،مقاومت انتروکوکوس و مایکوباکتریوم توبرکلوزیس به وانکومایسین وهمچنین باکتری هایی عامل عفونیت بیمارستانی که حداقل ۷۰ درصد از آنها به یکی از داروها ی درمانی مقاوم می باشند.از این رو در حال حاضر بیش از هر زمان دیگر نیاز به یافتن کلاس های جدید آنتی بیوتیکی جهت مبارزه با مقاومت دارویی (MDR)^[2]سویه های خاص با هدف منابع درمانی دریایی مورد توجه قرار گرفته است (Devi et al., 2010).
آلودگی های قارچی شیوع جهانی پیدا کرده و آمار مرگ و میر بالاییداشته است.برخی مطالعات نشان داده که مصرف داروهای ضد قارچی و ضد ویروسی توانایی سیستم ایمنی بدن را کاهش دادهو نیزمصرف داروهای ضد قارچی به دلیل اثرات جانبی محدوده شده اند. با وجود مقاوم شدن سویه های قارچی به تریازول(Triazol) بایستی ترکیبات جدیدتر و قوی تری جهت مهار رشد قارچ های بیماریزا و البته بدون اثرات جانبی استخراج شوند.(Joseph and Sujatha, 2011)
ارگانسیم های دریایی منابع غنی از متابولیت های ثانویه هستند ساختار ترکیبات جدید شیمیایی و فعالیت بیولوژیکی منحصر به فرد دارند. تاکنون افزون بر ۱۵۰۰۰ ترکیب مختلف از موجودات دریایی استخراج شده (Dhinakaran and Lipton, 2012)که بیش از ۵۰۰۰ نوع ترکیب و ۸۰۰ آنتی بیوتیک جدید از ۵۰۰ گونه ی اسفنج دریایی کشف شده است (Darah et al., 2011).
۱-۵اسفنج های دریایی منابع غنی از ترکیبات فعال زیستی
ازآنجایی که اسفنج ها دارای سیستم دفاعی کمی هستندو از نظر اکولوژی شیمیایی جهت دفع حیوان مهاجم توسعه ی کمی یافته است جهت بقاء گونه ی خود به توانایی آنها برای مقابله و تضعیف موجودات مزاحم زیستی ، مهار میکروب های بیماری زا و ارگانیسم های آلوده کننده ی دیگر بستگی دارد. (Newboldetal., 1999).
تحقیقات نشان داده که متابولیت های ثانویه ی اسفنج احتمالا نقش مهمی در دفاع اسفنج علیه برخی خطرات زیستی دارند (Newbold et al.,1999).درنتایج تحقیق دیگر بیان شده که تولید متابولیت های ثانویه اسفنج در حفظ زیست محیطی آنها در برابر مهاجمان،شکارچیان و دیگر رقبا نقش تعیین کننده ایدارند(Devi et al., 2010).در واقع اسفنج ها بیشترین تولید کننده ی ترکیبات جدید هستند که هر ساله بیش از ۲۰۰ متابولیت از آن ها گزارش می شود علاوه بر این بیشتر ترکیبات مشتق شده از اسفنج مانندترکیبات ضد سرطانی و ضد التهابی در آزمایش های بالینی و پیش بالینی (Jonson et al.,2012). از رده ی Demospongiae می باشد (Dhinakaran and Lipton et al.,2012).
۱-۶ تنوع متابولیت های ثانویه اسفنج دریایی
طیف وسیع متابولیت های ثانویه ازجمله مشتقات آمینواسیدها،نوکلئوزیدها، ماکرولیدها، پورفیرین ها، ترپنوئیدها، آلیفاتیک ها، اسیدپراکسیدها استرول ها، مواد زیست فعال استخراج شده ازاسفنج دریایی بوده و مشتقات ترپن ها،استرول ها،پپتیدهایحلقوی،آلکالوئیدها،اسیدهایچرب، پروکسیدهاوآمینواسیدها (اکثرأ هالوژنی می باشند ) از میکروارگانیسم های همزیست با اسفنج دریایی استخراج شده (Joseph and Sujatha, 2011 ) که در مواردخاص مربوط به بیوتکنولوژی مواد دارویی (با خاصیت ضدسرطانی،ضد باکتریایی،ضد قارچی،ضد ویروسی،ضدالتهابی)گسترش فراوانی یافته اند(Johnson et al., 2012).
۱-۷نقش ترکیبات طبیعی دریایی در زندگی انسان
در حال حاضر ترکیبات طبیعی نقش بسیار زیادی در علوم پزشکی و دارویی ایفا می کنند. در این میان ترکیبات طبیعی با منشاء دریایی در سال های اخیر بسیار حائز اهمیت می باشند. به نظر می رسد وجود ترکیباتی با ساختار استروژنی و اتم های هیدروژن دار (به دلیل محیط زیست جاندران دریایی در آب چنین ساختارهایی شکل می گیرند) این ویژگی آن ها را از سایر ترکیبات طبیعی متمایز می نماید(خاکشور و همکاران، ۱۳۹۱) .
شروع اولین مطالعات دارویی اسفنج ها سال ۱۹۵۰ با استخراج نوکلئوزیدهای spongothymidine وspongouridine از اسفنج دریاییCryptoethya crypta بوده که این نوکلئوزیدها پایه سنتز اولین عاملهای ضد سرطانی دریایی Ara-Cو ضد ویروسیAra-Aبوده اند. Ara-C برای درمان بیماری های لوسمی و لنفومی انسان کاربرد بالینی پیدا دارند (Dhinakaran and Lipton, 2102).
Nigrelli و همکاران در سال ۱۹۵۹ اولین گزارش عصاره ضد میکروبی اسفنج را ارائه کردند. بعداز آن شمار زیادی از گزارشات در زمینه استخراج عصاره ضد میکروبی از اسفنج دریایی به دست آمد امادراین میان بررسی هایی در مورد میکروارگانیسم های بیماری زای انسانوجود نداشته است (Newbold et al.,1999).
به دلیل افزایش بیماری های خطرناک از قبیل سل،ایدز،مالاریا و سرطان ها ایده ی کشف مواد جدید از موجودات دریایی و به طور خاص اسفنج ها اوج گرفت(Dhinakaran and Lipton, 2012).
۱-۸ متابولیت های فعال زیستی اسفنج دریایی با خواص دارویی